Kryobank
Technik

Die Technik der Kryokonservierung

Unter Kryokonservierung (von griechisch: Kälte und lateinisch conservare = erhalten, bewahren) versteht man das Aufbewahren von Zellen durch Einfrieren in flüssigem Stickstoff.

Bei bis zu -196°C werden die Zellen in einen biologischen Ruhezustand versetzt, alle Stoffwechselvorgänge der Zelle kommen zum Stillstand. Nach dem Auftauen nehmen die Zellen ihre normalen physiologischen Prozesse wieder auf. Eine Lagerung über viele Jahre ist möglich.

Unterschiedliche Einfriergeräte für unterschiedliche Zellen

Unterschiedliche Zellen und Gewebe benötigen dabei jedoch unterschiedliche Vorbereitungen, wie Zusatz von Gefrierschutzlösungen und unterschiedliche Einfriergeschwindigkeiten. Auch sind die Einlagerungsgefäße unterschiedlich. Eine Lagerung im flüssigen Stickstoff, jedoch auch in der - sich kurz darüber befindlichen - Gasphase ist möglich.

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	Sperma in so genannten "straws", dünnen 12 cm langen Plastikhalmen, deren Enden nach dem Befüllen verschweißt werden. In einem solchen "straw" erwartet man ca. 5-10 Millionen Spermien.
	Ca. 6 cm lange 'straws' zur Aufnahme von 1-3 (befruchteten) Eizellen. Sicher verschlossen werden sie durch eine 1,5 mm Stahlkugel, alternativ werden straws mit Verschweißungsmöglichkeit eingesetzt.
	Befruchtete Eizellen im 'straw' - hier im Stickstoffbad. In jedem straw befinden sich üblicherweise 1-3 befruchtete Eizellen.

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Je nach Zell- und Gewebeart und je nach gewählter Einfriertechnik ist die ‚Auftauqualität' unterschiedlich. Spermien lassen sich üblicherweise sehr gut kryokonservieren. Das heißt, der Qualitätsverlust ist geringfügig. Das gleiche gilt für Hodengewebe. Unbefruchtete Eizellen lassen sich mit sehr guter Auftauqualität nur per Vitrifikation konservieren.
'Teil-befruchtete' Eizellen, sog. PN-Stadien, lassen sich per Slow freezing, dem noch am häufigsten angewendeten Verfahren, mit etwa 65 % Auftaurate konservieren. Wird die Vitrifikation eingesetzt, steigt die Auftaurate auf bis zu 98 %.

Es gibt also zwei Verfahren zur Kryokonservierung von Eizellen, befruchteten Eizellen, Embryonen und Geweben:

• das langsame Einfrieren (Slow Freezing) und
• die Vitrifikation (ultraschnelles Einfrieren).

Ganz anders verhält es sich bei den sogenannten "befruchteten Eizellen" (richtiger: vorbefruchtet), die im Rahmen der Reagenzglasbefruchtung entstehen. Hier ist mit 80 - 100 % Prozent mit der weiteren Entwicklung, also dem Abschluß des Befruchtungsprozesses, zu rechnen. Beim Einfrieren von Embryonen ist das ähnlich. Inzwischen etabliert ist auch die Gefrierkonservierung von Eierstockgewebe/Hodengewebe, welches vor Beginn einer Strahlen- und/oder Chemotherapie in einem operativen Eingriff gewonnen wird.

Slow Freezing

Der Verlauf der Gefrierkonservierung: Die Zellen werden in ein Gefrierschutzmedium eingebracht, anschließend werden Sie in flüssigem Stickstoff gelagert. Für die spätere Verwendung werden sie zunächst aufgetaut und das Gefrierschutzmittel wird entfernt.

Da die Zellen zu etwa 85 % aus Wasser bestehen, ist klar, dass es zur Bildung von extra- und intrazellulärer Eiskristallbildung kommen muß, die die empfindlichen Zellorganellen schädigen kann (mechanischer Stress). Diese Eiskristallbildung versucht man durch den Zusatz von Gefrierschutzmittel zu reduzieren oder ganz zu vermeiden. Allerdings muß auch eine mögliche Schädigung der Zelle (chemischer Stress) durch diese Chemikalien berücksichtigt werden.

Das Überleben einer Zelle während der Kryokonservierung hängt wesentlich vom Gleichgewicht dieser Faktoren ab.

Vitrifikation

In diesem Zusammenhang stellt die Vitrifikation ein anderes Verfahren der Kryokonservierung dar, da es bei dieser Methode, im Gegensatz zum langsamen Einfrieren, nicht zur Bildung von Eiskristallen kommt. Die nach entsprechender Vorbehandlung glasähnlich erstarrten (glasähnlichen) Flüssigkeiten geben dem Verfahren seinen Namen. Dieser glasähnliche oder auch amorphe Zustand wird durch Anwendung einer Kombination von Gefrierschutzmitteln (Kryoprotektiva) in erhöhter Konzentration und mit sehr hohen Abkühlraten (–2000 °C/min bis –20.000 °C/min) erreicht.

Hinzu kommt, dass Zellschädigungen, die durch das Abkühlen entstehen, weitgehend vermieden werden können. Ein anderer Vorteil dieser Technik liegt darin, dass die Vitrifikation weniger Zeit benötigt und geringere Kosten verursacht, da der Einsatz programmierbarer Gefrierapparate nicht notwendig ist.

Risiken der Vitrifikation

Diese Methode wurde Mitte der 90ger Jahre in die Reproduktionsmedizin eingeführt. Anfänglich und teilweise noch bis heute dauert die Skepsis, wonach die hohe Konzentration der Kryoprotektiva irreversible Zellschäden hervorrufen könnte. Um dieses Risiko zu reduzieren, werden Mittel sehr unterschiedlicher Molekülgröße oder Zusammensetzung verwendet, wodurch die Toxizität jedes einzelnen Mittels deutlich reduziert wird. Durch die sehr kurze Zeitdauer zwischen Zufügung der Mittel und der eigentlichen Vitrifikation bzw. zwischen der Wiedererwärmung und der kompletten Entfernung vor Weiterverwendung ist dafür verantwortlich, dass das Verfahren heutzutage extrem schnell an Bedeutung gewinnt.

Inzwischen gibt es mindestens zwei namhafte Eizellbanken weltweit: in Atlanta (Centre of Human Reproduction) und innerhalb der spanischen IVI- Kette. Am 22.-25. April 2010 wurde in Valencia, Spanien der erste Internationale Kongress zu „Controversies in Cryopreservation of Stem Cells, Reproductive Cells, tissue and Organs“ veranstaltet, an der auch Dr. Peet teilnahm. Die von verschiedenen international renomierten Arbeitsgruppen vorgelegten Ergebnisse, die zum Teil noch nicht publiziert sind, beweisen, dass die Vitrifikation kein größeres Gefährdungspotential aufweist als das „slow freezing“. Es gibt derzeit keine klinische Studie, die ein nachhaltiges Schädigungspotential (besonders hinsichtlich kindlicher Fehlbildungen) der Vitrifikation, oder auch des „slow freezing“ darstellt.
Die Zentren gehen inzwischen so weit, daß sie z.B. im Bereich der Eizellspendetherapie kaum noch frische Eizellen, sondern vielmehr vitrifizierte Eizellen der Spenderinnen verwenden.

Lagerung

Bei der Berliner Samenbank lagern viele Tausend Spermaproben und hunderte befruchtete Eizellen.

Der Füllungszustand der einzelnen Lagertanks wird in regelmäßigen Abständen, zum größten Teil automatisiert, kontrolliert und aufrechterhalten.

Eine computergestützte und mehrfach gesicherte Datei gewährleistet jederzeit die eindeutige Zuordnung der Behältnisse zur jeweiligen Person bzw. zum jeweiligen Spender. Eine Verwechslung oder der Verlust ist damit unmöglich.

Jede Spermiencharge (mehrere straws einer Samenportion) lagert in speziellen Sammelhaltern. Sowohl die "straws" als auch diese Sammelhalter sind eindeutig markiert und in Metallköchern gesammelt.

Im Stickstofflagerungstank lagern jeweils 6-8 solcher Köcher.

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	(leere) Spermien "straws" neben strawhalter
	Lagerung der strawhalter im Köcher
	Lagertanks mit Fassungsvermögen von jeweils 8 solcher Köcher
	Kopf eines Flüssigstickstofftanks, der wöchentlich nachgefüllt wird. Der Verbrauch ist einerseits abhängig von der Öffnungsgröße des Stickstofftanks, andererseits von der Anzahl der Benutzungsvorgänge des jeweiligen Tanks. Daher ist ein zusätzlicher Stickstoffnachfülltank erforderlich.

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Durch das Verschweißen jedes einzelnen "straws" wird der direkte Kontakt der Proben untereinander verhindert. Eine andere Verschlussmöglichkeit ist das Verschließen mittels eines Stahlkügelchens. Das Auslaufen und eine, sonst denkbare, Kontamination (Keimübertragung) wird dadurch sicher ausgeschlossen.

Die Lagerung ist unabhängig vom elektrischen Strom. Selbst bei einem totalen Stromausfall, und damit Ausfall der automatisierter Meß- und Füllvorrichtungen ist eine Probenbeschädigung, durch die Behälterfüllung, für mindestens 2-3 Wochen ohne das Einschreiten unserer Mitarbeiter ausgeschlossen. Unser Labor ist jedoch ohnehin täglich besetzt.

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